医学论文代写范文:人脑心肌炎病毒IgM捕获ELISA方法建立与初步应用

发布时间:2015-06-07 10:05:22 论文编辑:lgg

第一部分文献综述


1脑心肌炎病毒(EMCV)概述
不像其他病毒成员及其庞大,脑心肌炎病毒只是微RNA病毒科(PicoRnaviridae),心病毒属(Cardiovirus)的唯一成员,根据分离来源的不同,有时也称哥伦比亚-SK (CoLumbia-SK)、小鼠脑脊髓炎病毒(MEV)、门哥(Mengo)病毒1945年在美国佛罗里达州,从一只患急性致死性心肌炎的黑猩醒体内,首次分离到EMCV,并在1958年在巴拿马首次证明导致猪死亡的病原体是EMCV,随后有报道,在世界上很多国家爆发和流行EMCV的彷主广泛,如喃齿类动物、某辟哺乳动物以及灵长类动物等,引起的急性传染病的主要特征为:脑炎、心肌炎以及心肌周围炎等。哨齿类动物巾的大鼠和小鼠是EMCV的自然宿主,感染后主要以脑炎而致死,并由鼠传播给其他动物,且当EMCV引起的脑心肌炎暴发时,氣类感染已较严重;哺乳动物中以猪对EMCV的敏感性最强,感染后多出现致死性心肌炎和心肌周围炎,处于妊源期的母猪大多出现死胎、弱胎、流产、木乃伊胎等繁殖性障碍,其他的表象中,健康猪多呈隐性感染[11-13],据有关报道,猪脑心肌炎发病高的地区,人感染EMCV也较高[I4];灵长类动物中主以人类为主,人类被EMCV感染后,大多出现头痛、发热、精神姜靡、身体僵硬、呕吐等主要症状,有学者从患者和其他正常人群血清中检测到EMCV抗体,并从患脑膜炎和脑炎的儿童体内分离EMCV。
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1.2 EMCV的生物学特性
脑心肌炎病毒和其他部分小RNA病毒有着类似的组装结构和抗逆的理化特性,如常见口蹄疫病毒(FMDV)。病毒粒子呈圆形状,直径为20?30nm,无囊膜裸露的核衣壳,在CsCL中的浮密度为:1.34g/cm3,沉降系数为:156S,病毒粒子的衣壳为对称结构的二十面体,衣壳内含一单股正链RNA,3’端有poly A尾,5'端没有帽子结构,但有2kDa的小分子量蛋白VPg,蛋白衣壳是由4种不同的蛋白质构成的60个衣売粒子组装的,这4种蛋白质为:VP1、VP2、VP3、VP4(由VP2裂解的);其分子量分别为:34、30、26、7kDa,该衣壳在CsCL中的浮密度为:1.33-1.34g/cm3。本病毒在甲酸、酸、84、电离福射条件下极易失活,在56°Clh能灭活,但对氣仿、乙醚、乙醇等脂溶剂以及SDS等去污剂有很张的抵抗力。在PH3?9时,EMCV稳定而不易失活,长期可保存于-70°C。鼠、猪、猴易感EMCV,但大多表现为隐性。宿主带毒后,经II便排到体外。通常情况下,致死性感染多发生于20周岁以内的幼龄动物,常见的为仔猪,隊可经非胃肠道或者口感染,5天左右死亡。在感染EMCV后,经3?5的潜伏期,就会出现短时间的发热,急性心肌炎等症状,有的还会出现精神萎靡,毛发粗糙而逆势,走路打颤而不稳,呼吸急促,之后不久就死亡,但多数无任何征兆而突然暴堯。剖检可见腔内冇积水,肝脾肿大,心脏多出可见白色斑点,直径在3?15mm,而且还有很多病理组织学检查的症状。EMCV能在仓鼠细胞系(BHK-21)、鼠胚成纤维细胞、非洲绿猴肾细胞(Vero)以及许多代肾细胞系等细胞培养物中生长和快速病变。EMCV有血凝性,通过血凝实验观察到其可凝集绵阳红细胞,针对该病毒的特异性抗血清可抑制该凝集反应、同柄毋株问的凝集反应的活性不一。EMCV只有一个血清型,由此,可建立相应的酶联免疫法(EUSA)检测相应的抗原或抗体。
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第二部分实验研究


第一章酶标抗原制备(EMCV-HRP)
收集96孔板中已病变的孔,反复冻融3次,3000rprn/niin离心lOmin,收上清去除细胞碎片,l0000rpm/min离心l0min,收上清去除大分子杂蛋白。参照总RNA提取试剂盒(离心柱型)操作步骤,提取EMCV涛液总RNA,操作如下:取上述EMCV毒液280miL于无蘭离心管(1 .SmL),加入(裂解液),充分均匀震荡,15-3°C放置6min,使得核酸蛋内复合物完全分离:吸入 220氯仿,剧烈霞荡 15,15-30°C 静置 3-4min,4°C, I3400xg、lOmin,吸上清于另一支离心管中;加入0.5倍(约35|aL)体积无水乙醇,充分混匀,液体全部移入吸附柱中,4°C,13400xg、Imin,弃离心废液;加入50(HiL去蛋白液RD,4°C,13400xg离心liiiin,弃离心废液;向吸附柱中加入 70(VL 漂洗液 RW,15-30°C静置 2min,4°C,13400xg, Imin,弃离心废液;加入 500iaL 漂洗液 RW, 15-3°C静置 2min,4V, 13400xg, Imin,弃离心废液;I3400xg, 2iTiin,去除残液,吸附柱静置5min,取汁,将吸附柱移入新的已做标记的离心管中,加入RNase-free ddH.0 60miL,4°C,13400xg, 2min。弃吸附柱,留离心液备用。
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2方法
在本实验室保存的细胞库中复苏一支vero细胞,操作如下:从液氮耀中缓慢取出已冻存的vero细胞,快速置于37°C水浴中,充分晃动,直至冻存管里融化成液体;将上述液体吸入50ml,细胞瓶巾,加入10%NBS DMEM培养艰1 0mL, WT37°C、5%C02培养箱中培养。48h后,弃上清,加少许胰蛋白酶消化片刻,弃胰蛋白酶,加10%NBS DMEM培养基缓慢吹打,稀释成40mL,铺96孔板。两天后,观察已铺的96孔板生长状况,当达到90%左右时,即可接毒。用无血清DMEM稀释EMCV(VR-129B株),先10.1稀释后0.22m膜过滤除菌,再10—3, 10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,10.1° 稀释备用。用无血清DMEM洗细胞已长到90%左右的96孔板3次,之后将稀释的毒液种到板中,100miL/L,置于37°C、5%C02培养箱中吸附2h。加6%NBS DMEM, 100 miL/L,使其终浓度达到3%,置于37°C、5%C02培养箱中培养观察。4天初判,7天后终判,依照Reed和Muench氏法计数TCIDso。
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第三章质量评价及初步应用........ 42
1 材料........ 42
2质量评价........ 43
2.1灵敏度验证........ 45
2. 2重复性验证........ 46
2. 3特异性验证 ........47
2.4稳定性验证........ 47
2.4. 1长期稳定性验证........ 47
2. 4. 2热加速稳定性验证 ........48
2.4.3运输稳定性........  49
2. 5与间接ELISA法比较........ 50
3 应用........50
3. 样本处理........ 50
3.2 EMCV IgM捕获ELISA检测样本........ 54
3. 3双抗原夹心法检测样本........56 
4结论 ........ 57
4. 1人EMCV IgM捕获ELISA方法的验证结果........ 57
4. 1. 4稳定性验证结果........ 58
4. 2与间接ELSA比较结果........ 59
4. 3样本检测结果........ 60
5小结与讨论........ 62


4结果


4. 1EMCV I gM捕获EL I SA方法的验证结果
人EMCVIgM捕获ELISA方法条件优化后,进行了验证,结果显示:能检测样本到1: 640; 3批试剂(包被板,其他试剂)的批内及批间变异系数均小予5% 只能检测人EMCV IgM抗体;板子和试剂可长时间放置和良好热稳定性;说明该人EMCVIgM捕获EUSA方法灵敏、精密、特异和稳定。在人EMCV IgM捕获EL1SA法的建立中,首先得确定包被的浓度,否则包被过高,会出现假阳性,过低会出现假阴性;其次是EMCV-HRP的工作浓度,EMCV-HPR变化很小的浓度,都会造成结果很人的变化,当EMCV-HPR的浓度高,会导致一些非特异性反应,过低会影响检测的敏感度。该法条件的优化是使用方阵滴定法,在此过程巾,除须优化的条件外,其余的其他条件都是f等杈准如:温度、酶标仪、PBST、移液枪、枪头等,不能随意更改。在做实验前,所有的试剂、包被板和样本,须提前置于室温(25°C左右)放置30min,以便实验准确减小误差;抗人IgMOi链)单抗开盖后须加50%的甘油,分装成若T支小管,-20°C保存,以便随吋取用,且避免反复冻融;在加样、配制EMCV-HRP工作液、PBST洗板、加AB液及终止液等,使用同一标尺和同一人操作,试验后测OD值前,须混匀反应液终止,且在酶标仪测量之前,选择合适的调零孔,测OD值;试验后,所有的废弃物须高压消毒后,方可弃之,以保证环境洁净和人的安全。

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结论


1通过PEG-6000浓缩和密度梯度离心获得了纯度较好的EMCV;并成功的进行了灭活和酶标记。
2初步建立人EMCV IgM捕获ELISA方法;制备了合适的阴阳性质控品。
3通过条件的优化和方法的验证,筛选出该法的最适条件;且该法灵敏、精密、特异和稳定,从而可以应用于实践的检测。
4经人EMCV IgM捕获ELISA法检测了 1077份人血,阳性率为:13.74%(148/1077),得知这批样本感染情况,从而确定预防和的治疗措施。
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参考文献(略)

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