多肽促人表皮生长因子透皮输运机理及其应用研究

发布时间:2015-06-18 10:55:36 论文编辑:jingju

第1章绪论


1.1透皮给药技术
透皮给药技术(transdermal delivery technology),是指通过在皮肤表面敷贴或涂抹的方式给药,使药物以一定速率渗透进皮肤,并到达体循环,从而实现某些疾病的治疗[1]。这种全新的给药方式为不便于口服或者需要长期注射的药物提供了安全有效的用药途径[2]。通过皮肤渗透的药物不会被体内酸碱性物质、食物、代谢过程等因素影响,同时避免了肝脏的首过效应,也能有效防止药物吸收过快导致体内血药浓度过快升高造成的各种不良反应[3]。透皮给药还可以持续控制给药的速度,较其他给药方式相比更灵活。其人性化的治疗特点加上目前透皮给药技术的快速发展,使得透皮给药技术具有广阔的发展前景[4]。然而,在外用新剂型研发中,皮肤作为人体最大的器官,其表面的角质层形成了致密的屏障,许多药物无法渗透进入皮肤被吸收,特别是大分子类药物,如多肽、蛋白质、DNA等,通常认为分子量大于500道尔顿的分子都无法穿透皮肤[5]。同时,一些药物自身性质往往会制约着配方的选择,比如药物分子的酸喊性、大小和溶解性等。目前已有许多新的透皮方法得以发现并有效提高了药物的皮肤渗透和扩散,如常规的物理方法包括超声法、微针法和离子导入法;常规的化学促透剂典型的有氮酮类化合物、表面活性剂、多元醇等。除此之外新型的生物类透皮促进剂如细胞渗透肽也得以迅速发展和应用。透皮给药具有独特优势,但目前机理并没有完全清楚,应用过程中仍受到很大限制[6]。在透皮制剂的产业化方面,美国于1979年批准使用东茛窘碱透皮治疗晕车,用于缓解反胃呕吐病症。十年之后第一个尼古丁贴剂透皮的出现,大大提升了公众对透皮给药的支持和关注[7]。到现在为止己经诞生了包含双氯芬酸钠、芬太尼、利多卡因和睾酮等多种药物、或者包含多个避孕和激素替代药物的组合方案,以及用于镇痛的离子和超声波导入的传输系统等19种透皮给药系统。1979年至2002年,平均每2.2年就有一个新的透皮给药系统获得批准。之后的5年中,这个速度己经超过了三倍。而据估计目前每年生产的贴剂都超过了十亿。新型透皮给药产品的研究也受到了广泛的关注[8-10]。

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1.2透皮增强肽
有一类生物多肽,能快速穿透进入哺乳动物细胞中,并且仍保留原有结构和功能,但是它们不依赖于胞吞作用进入细胞,这类多肽被称为细胞穿透肽(cellpenetrated peptide, CPP),该类多肽富含喊性氨基酸,因此通常带正电荷。这也与蛋白质转导功能具有紧密关系。也有人将这类短肽称之为膜转位序列[37]。CPP不仅可以自身穿透细胞,也可以装载其他物质并促进这类物质的细胞渗透,如蛋白质、DNA、siRNA、脂质体以及纳米材料等[38]。这类物质的发现为细胞给药技术提供了方便途径。1988年,Frankel等人发现的HIV反式激活蛋白是一个经典的细胞渗透肽,它可以穿透细胞并激活病毒基因组的转录[39,40]。CPP种类很多,是一个庞大的家族(见表1.1)。根据CPP的来源,可分类3类:1)天然CPP,这类多肽指的是天然蛋白的某个多肽区域,典型的有TAT (来源于HIV)和penetratin (来源于风毒素蛋白);2)利用富含碱性氨基酸的特点,人工合成的多聚精氨酸或者多聚赖氨酸(poly-Arg)等多肽同样也具有跨膜能力,并且可以对多肽的透皮能力进一步优化;3)融合CPP,是有2条或2条以上天然或者人工合成的CPP融合后形成的新CPP[41, 42]。细胞渗透肽的作用机制目前正在研究中。研究者们通过焚光标记技术证明CPP进入细胞是一种非能量依赖性过程,即不依赖于经典的胞吞作用。CPP进入细胞时不与手性受体作用。CPP主要通过交联或者共价融合的方式加载药物[43]。J.B.Rothbard等人将重复的Arg序列和环保菌素A连接形成共聚物R7-CsA能有效促进环保菌素A透皮,而对照组环孢菌素A没有透皮能力。R7-CSA还能渗透进皮肤中的T淋巴细胞并抑制皮炎症状[30],这是细胞渗透肽首次报道可以用于透皮给药,这为后期细胞渗透肽在透皮给药领域应用打开了先河。
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第2章实验与方法


2.1分子实验方法
1.取2.5jiL待转化的质粒和50nL大肠杆菌感受态细胞,轻柔混勾,冰上放置30分钟。
2.迅速将EP管转移至42°C水浴中热激90秒,再迅速冰浴2分钟。
3.加入200mL不含抗生素的无菌LB培养基,在37°C摇床中培养30分钟。
4.取l00uL转化产物涂布到含有抗生素的LB平板中,并在37°C环境放置14小时
5. LB平板制备:在LB培养基中加入15g/LAgar粉末,12rC灭菌20分钟,待灭菌后温度降至约5°C时加入抗生素,摇勾后倒入l0mL左右液体至玻璃平板上,冷却后4°C暗处储存。
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2.2细胞实验方法


2.2.1细胞培养
材料:细胞培养皿、胎牛血清、DMEM培养基、Trypsin胰酵
方法:鼠胚胎成纤维细胞系Balb/c 3T3细胞、人角质形成细胞系Hacat细胞、人肺癌细胞系A549细胞、人黑色素瘤细胞系B16细胞均培养在含有10%胎牛血清、l00U/mL青霉素、l00g/mL链霉素的DMEM培养液中,放置于含5%C02 (v/v)培养箱中。所用细胞均为对数生长期细胞,并每天更换培养液,细胞汇合度达到90%时进行传代。细胞培养皿在使用前用0.1%明胶在37°C中预包被30分钟,用PBS清洗3遍后待用。
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第3章实验结果......... 49
第1节TDl-hEGF融合蛋白制备和活性鉴定......... 49
第2节TDl-hEGF透皮能量依赖性研究......... 62
3.9 引言......... 62
3.10能量抑制剂对TDl-hEGF透皮的影响......... 62
3.11 温度对TDl-hEGF透皮的影响......... 63
3.12 ATP对TDl-hEGF透皮的影响......... 64
3.13 皮肤活性对TDl-hEGF透皮的影响......... 66
3.14能量类似物对TDl-hEGF透皮的影响......... 66
3.15 TDl-hEGF在人皮中的透皮......... 66
3.16 本节小结......... 68
第3节TD1与Na+,K+-ATPase相互作用研究......... 69
第4节透皮模型的建立......... 77
3.25 引言......... 77
3.26透皮给药理论建模......... 773
3.27 TD1不同初始浓度对传质的影响......... 82
3.28 hEGF不同初始浓度对传质的影响......... 84
3.29 本节小结......... 84


第3章实验结果


第1节TDl-hEGF融合蛋白制备和活性鉴定
3.1引言
目前在透皮肽TD1相关的研究中,TD1都是与蛋白类药物通过简单混合方式进行透皮给药,这是否是最优的给药方式呢?我们知道,利用嚼菌体展示技术蹄选透皮肽时,无论是TD1、SPACE或是T2肽,它们都是以环型结构与唾菌体共价连接[49],如SPACE肽能够高效促进siRNA进入皮肤也是将SPACE和311^八进行交联[54,57]。因此,是否可以将TD1片段和蛋白类药物片段连接形成一个整体分子使得TD1更好携带药物分子透皮,从而提高药物分子透皮效率?为了验证这一假说,我们设计将TD1和hEGF用分子生物学方法连接到一起形成一个融合的多功能蛋白,使得这个蛋白质分子同时具有透皮增强功能又具有表皮生长因子的生物学活性。由于蛋白的结构决定了蛋白的功能,因此我们需要在两个分子之间添加一个连接物(linker),让TD1分子和hEGF分子之间有足够的空间独立行使功能,也防止了分子在形成过程中的错误折叠引起结构的变化而影响蛋白分子的活性。Linker是由5-10个氨基酸组成的短肽,在蛋白质分子翻译过程中将两端分子连接。通常linker应由多个重复的惰性和柔性的氨基酸组成,比较常用的是甘氧酸,由甘氨酸重复序列组成的肽段呈线性,具有一定的柔性。本节我们通过体内、体外透皮实验验证TDl-hEGF融合蛋白具有显著的皮肤渗透能力,同时通过MTT实验、ERK实验以及细胞迁移实验验证了 TDl-hEGF具有天然hEGF的促细胞增殖能力。TDl-hEGF通过linker连接的融合蛋白具有热稳定性,linker结构稳定,皮肤内物质不会造成蛋白的降解[117]。
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结论


透皮增强肽于2006年被发现,至今已经成功携带多种蛋白类药物透皮,充分说明了透皮增强肽的强大作用和应用前景。TDl-hEGF是透皮肽应用中的一个新的尝试与挑战。将透皮肽序列与药物序列以融合方式连接形成一个新分子,大大降低了生产成本,提高了药物吸收效率。原来蛋白药物与透皮肽的制备是分开的,每种药物的获得都要付出大量时间与劳动。现在融合蛋白形式的TDl-hEGF只需要制备生产一种药物。融合形式的TDl-hEGF不仅具有优秀的透皮吸收功能,也具有与天然人表皮生长因子相同的生物学活性。此外,药物的透皮效率也可通过简单方法进行升级。比如以多TD1序列串联融合模式设计药物可进一步加强药物的透皮效果,也可以通过在给药配方中添加ATP以增强皮肤对TD1分子的运输能力。在临床应用中,hEGF的生理学活性是Ing/mL,我们研究证明TDl-hEGF以1:1形式的融合已经可以满足hEGF透皮并达到其在皮肤中的生理学活性。TDl-hEGF具有优良的热稳定性,在皮肤中作用时间长,不会被皮肤中蛋白酶降解,TDl-hEGF进入血液中可以迅速被降解。因此TDl-hEGF安全、高效、对配方限制性低,具有很广泛的应用价值,它即可以应用皮肤资伤、烧伤等外伤的修复,促进愈合,也可以应用于美容护肤领域。通过TDl-hEGF的透皮吸收促进表皮细胞增殖、胶原蛋白和透明质酸分泌,增加皮肤弹性,修复皮肤症痕。此外,TDl-hEGF与抗菌类药物联合使用可加强抗菌类药物作用效果,缓解炎症,修复炎症引起的皮肤损伤。
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参考文献(略)

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