引言
1. 肺癌的发展及现状
肺癌是现今死亡率居首位的肿瘤[1]，占全世界所有癌症死亡人数的1/3，发病率占男性和女性肿瘤发病率的第二位，且历年来发病率和死亡率都呈显著增长趋势。从组织学分类上来说，非小细胞肺癌占所有肺癌病例的85%，小细胞肺癌约占15%。小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer，SCLC)是神经嵴来源的肿瘤且对化疗药物初始治疗反应良好，但往往产生耐药性而复发。非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)是肺上皮细胞组织来源，由多种组织学类型组成，主要的三大类包括腺癌，鳞癌，和大细胞肺癌。虽然近些年的研究使得诊断和治疗方式有了较大进展，但是非小细胞肺癌常常发现时就处于晚期，且常伴有较差的预后，其5年生存率仍处于15%左右，一旦出现转移，在传统化疗治疗手段下，平均生存期只有10个月左右。因此，这对于新的治疗手段和方式都提出了更高的要求。
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2. 表皮生长因子受体(EGFR)及其靶向药物
近年来针对肺癌的治疗有很多突破性进展，尤其是针对突变基因的勒向药物的研究显得至关重要。非小细胞肺癌的驱动突变基因有多种，如k-ras突变，表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)突变，ALK 突变等。其中表皮生长因子受体（EGFR)在17%的NSCLC病例中有表达，而且其表达与肺癌预后不良相关。这两个因素使得EGFR及其家族成为靴向治疗的主要候选者。分子水平的分析表明，在多数情况下，对药物有反应的患者在编码EGFR基因上带有特定的突变。第19外显子的第747至750位氨基酸的缺失突变（DelE746-A750)占45%,第21外显子的858位替换突变（L858R)占40?45%[2]，还有约10%的突变在第18和第20外显子中。突变的EGFR激酶高度活化，肿瘤细胞的存活高度依赖突变体激酶。有针对性的开发和表皮生长因子受体抑制剂的临床应用为肺癌提供了新的治疗选择，同时也拓宽了肿瘤靶向治疗领域。针对EGFR突变的靶向药物酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)的治疗效果显著。临床数据表明EGFR TKI对77% EGFR突变患者有效，但往往在首次治疗6至12个月之内出现药物抵抗[4]。因此新的治疗需求变为探索和研宄新的治疗药物或方式来对抗或阻止TKI抵抗的EGFR突变非小细胞肺癌，或者发现EGFR突变的其他可利用的弱点作为新的治疗指向靶点。
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3. DNA损伤及其修复机制
DNA损伤修复是恢复正常DNA序列结构和维持遗传信息相对稳定的细胞生理过程。DNA损伤修复基Si可修复不同原因导致的DNA损伤，从而保护遗传信息的完整性[5]。细胞主要通过有六条修复通路来应对不同形式的损伤[6，7]: (1)直接修复（DirectRepair，DR)：修复焼基鸟嚷呤引起的损伤；（2)碱基切除修复(base excision repair, BER)通路，针对氧化还原或烧基化引起的碱基损伤；（3)核昔酸切除修复（nucleotide excision repair，NER)通路，修复辖射、化学药物或蛋白-DNA交联引起的核苦酸水平的损伤；（4)碱基错配修复（mismatch repair,MMR)通路，纠正错配碱基；（5)同源重组修复（homologous recombinationrepair, HR)和（6)非同源的末端连接（non-homologous end joining，NHEJ)闻。其中，DNA双链断裂是DNA损伤最致命的形式，细胞建立了一套复杂而而精确的调控机制来应对这些损伤。DNA损伤修复通路的激活对于维持基因组的完整性有非常重要的意义，这些修复通路中重要元件的功能缺失会增加基因突变和发生肿瘤的概率。在多种DNA损伤修复通路中，同源重组修复（homologousrecombination repair, HR)和非同源的末端连接（non-homologous end joining, NHEJ)专门修复DNA双键断裂损伤。
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第一部分测验DNA损伤水平多种EGFR突变及野生型细胞系对各种药物的反应
一、实验目的
1.测定不同药物对不同EGFR突变型人非小细胞肺癌细胞系造成的DNA损伤。
2.分析DNA损伤水平，评价药物敏感性。
二、实验材料与方法
(一)实验材料
1I.主要试剂和材料
y -H2AX 焦点染色试剂包括 Anti-gamma H2AX (phospho SI39) Mouse rtiAb和 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG，分别购于美国 Millipore 与 Invitrogen 公司。化疗药物包括顺铀（Sigma Cat. #P4394)，依托泊苗(Sigma Cat#E1383)，培美曲塞（LClabCat.#P7177)，喜树碱（SigmaCat. # C9911)，紫杉醇（SigmaCat. #T7191)。六个人非小细胞肺癌细胞系包括A549，PC9, HCC827, H1975, H3255, PC3，
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(二）实验方法
肿瘤细胞生长曲线近似”S"形，选择对数生长期细胞用于冻存。当显微镜下观察到细胞接近长满培养瓶底但仍为单层，且漂浮死细胞数量少，表明细胞生长状态良好，分列增值活跃。此时用消化液将细胞消化下来并收集于15ml离心管中，以800rpni/min转速离心5分钟，细胞沉淀于离心管底部形成小的团块，弃去上清液。加入含10%DMSO细胞冻存培养液，调整细胞浓度为5x106-5xl07/ml,用1000 U1移液器轻轻吹打均勾，分别装入无菌冻存管中，表明细胞株名称和冻存时间，封好的冻存管即可直接冻存入-8°C冰箱中。标准的冻存程序为降温速率l-2°C/min;当温度达到-25°C以下时，可增至5-10°C/min;到-ICKTC时，即可转移至液氮罐中长期保存。
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第三部分人体组织水平验证细胞系水平获得的结论.......... 37
―、实验目的 ........37
二、材料与方法........ 37
(一）实验材料........ 37
(二）实验方法........ 38
三、实验结果........ 39
四、实验讨论........ 41
五、实验结论 ........ 42
讨论
通过上述实验结果可以看出，在依托泊苷处理后的EGFR突变型肿瘤组织的DNA损伤程度是EGFR野生型肿瘤组织的3倍之多，这证实了我们在细胞系中得到的结论，同时也证明了 Y-H2AX分析法在肿瘤组织中的可行性和敏感性。由于实验条件的限制，我们在本次研究中未能大量测试组织样本，进一步的实验可考虑扩大样本量，并将此发现与临床数据相结合，如分析EGFR突变非小细胞肺癌患者与EGFR野生型非小细胞肺癌患者对依托泊苷临床治疗效果的数据，获得进一步的证据。
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结论
癌症治疗领域亟需新的手段来确证候选药物的有效性。一种可能的方法是增加临床试验的效率和速度，通过获得参加临床试验的癌症病人的活体样本，用生物检测方法衡量药效各项数据。由于很多抗癌试剂是通过损伤DNA或者影响DNA损伤修复通路产生作用，这提示我们可以采用基于DNA损伤终点的生物标记物。同时这一生物标记物还可以被用于评价放射治疗产生的效果，如识别对放疗过度敏感的病人从而减少其放射强度来避免副作用。最理想的生物标记物将是那些在治疗早期就能够识别药物是否达到其靶向位置并按照预期发挥作用P7]。最近几年的研究已经发现了一些新的生物标记物，尤其在对于药物试验期的药物。在这里，我们讨论一个具有代表性的药效标记物，Y-H2AX。Y-H2AX属于H2A组蛋白家族，四个组蛋白家族成员之一[38]。在形成DNA双链断裂的时候，成百上千个H2AX分子迅速被PI3K家族的蛋白酶成员催化磷酸化[22，39]，在DNA双链断裂处形成一个焦点。H2AX缺陷的细胞表现出细胞周期检查点缺陷，基因组不稳定性，以及对基因毒性药物过度敏感等特点，这也进一步证实了 Y -H2AX在修复DNA损伤方面的作用。完成DNA损伤以及染色质重建之后，y-H2AX会通过一些磷酸水解酶进行去磷酸化。
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参考文献（略）