本文是一篇医学论文，笔者探究奥利司他对高脂饮食与高淀粉饮食诱导肥胖个体的减重差异，肠道菌群在此过程中的作用，以及造成减重效果差异的宿主代谢机制，寻找增强奥利司他的减重作用提供新思路。
第一章 绪论
1.1 研究背景和意义
肥胖是以体脂含量高为特征的疾病，在生理学上被定义为长期能量正平衡（能量摄入大于能量消耗）导致的人体脂肪重量增加。身体将多余的能量以脂肪的形式储存在脂肪细胞中[1, 2]。能量平衡（摄入与消耗）的调节依赖于来自脂肪组织、胃肠道、胰腺、肝脏和大脑的各种激素的相互作用[3]，能量摄取过多导致脂肪细胞肥大、增生，并在其他非脂肪组织中形成内脏脂肪，从而诱发心血管、肝脏疾病。另外脂肪组织还可分泌脂肪因子和炎症因子影响局部微环境，诱导胰岛素抵抗、高血糖，并激活相关炎症信号通路，通过这些改变能够加剧肥胖相关疾病的发生和发展[4-6]。所以，超重或肥胖会显著增加罹患疾病的风险，譬如：动脉性高血压、血脂异常、2型糖尿病、冠心病、脑血管病、胆囊结石、关节病、睡眠呼吸暂停综合征和肿瘤[7]，这些疾病都与肥胖息息相关。且在过去50年里，全球肥胖的患病率急剧升高[8]；另外根据世界卫生组织的数据，2000年至2019年肥胖症在代谢性疾病死亡中占比最高，并成逐年增加的趋势[9]，所以世界卫生组织将肥胖定位为最重要的公共卫生问题之一。基于此开展肥胖的影响因素及治疗研究对改善人类健康和生活质量，促进社会经济发展具有重大意义。
1.2 研究现状
1.2.1肥胖的影响因素与治疗
在日常中肥胖的影响因素主要包括饮食、生活方式、内分泌调节和遗传学等各方面。其中饮食是能量摄入的主要来源，是影响肥胖的一个重要因素。例如西方人群饮食以高脂肪含量、精致糖为主，其特点不仅是能量摄入较高，还是一种不健康的高脂肪饮食，极易引起肥胖的发生。而亚洲人群以消耗大量碳水化合物为主，其中淀粉是高碳水化合物的主要来源之一，其特点也是易导致肥胖[10]。肥胖一直被认为是由于摄入食物增加和活动量减少而引起，故在其治疗方案中大多包含减少饮食热量和增加活动量两方面。尽管这些措施可以使肥胖患者在短期内减轻体重，但依从性差且失败率高。
肥胖管理的目标是改善健康状况，当总体重持续减轻10%以上不仅可以改善与肥胖相关的许多并发症，而且还可以提高生活质量。但是与其他慢性疾病一样，管理肥胖需要长期、多模式的方法，需要考虑到每个人的治疗目标，以及不同疗法的获益和风险。目前，国际上总结了肥胖的流行病学、诊断和治疗的最新证据，循证肥胖治疗包括5大类：行为干预、营养干预、运动干预、药物治疗和代谢/减重手术。对于行为、营养、运动等生活方式干预不起作用的肥胖或超重以及相关合并症的非妊娠患者，建议在调整生活方式的同时，应使用减肥药物[11]。目前美国食品药品监督管理局批准了6种可长期使用的药物：胰高血糖素样肽受体-1（GLP-1）激动剂（司美格鲁肽和利拉鲁肽）、替西帕肽（葡萄糖依赖性促胰岛素多肽/GLP-1激动剂）、芬特明-托吡酯、纳曲酮-安非他酮和奥利司他。其中除了奥利司他作用于外周系统，其他药物均作用于中枢神经系统。
第二章 材料与方法
2.1实验材料与设备
2.1.1实验动物
本课题所用实验动物为无特定病原菌（SPF），年龄为5周龄的雄性C57BL/6J小鼠，体重为16-18 g，通过浙江维通利华实验动物技术有限公司购买。
2.1.2主要试剂
（1）实验动物主要试剂。饲料辐照灭菌实验动物加工饲料，正常维持饲料（Ain-93，其配方为蛋白质20.3%、碳水化合物63.95%、脂肪15.75%），高淀粉纯化型饲料（配方为蛋白质15%、碳水化合物75%、脂肪10%），高脂肪纯化型饲料（配方为蛋白质15%、碳水化合物25%、脂肪60%），购于协同生物饲料高科技有限公司（中国江苏）；奥利司他胶囊，购于鲁南制药集团；氨苄青霉素钠、硫酸庆大霉素、万古霉素、甲硝唑，购于生工生物有限公司（上海）。
（2）基础实验主要试剂和耗材。甲苯、无水酒精、甲醇（MeOH，AR级）、Tris、甘氨酸、10% SDS，购于生工生物有限公司（上海）；伊红、苏木素染液、中性树胶，购于MDL；VG染色液，购于LEAGENE；IL-6（酶联免疫吸附试验法 货号：CSB-E04639m）、TNF-α（酶联免疫吸附试验法 货号：CSB-E04741m），购于武汉华美生物公司；One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit（10%），购于南京诺唯赞医疗科技有限公司；BCA浓度测定试剂盒、蛋白上样缓冲液（5×）、蛋白分子量marker，超敏ECL化学发光试剂盒，购于合肥Biosharp生物科技有限公司；印迹级厚滤纸；吐温（Tween）20，购于美国Sigma公司；β-actin抗体、HRP标记羊抗小鼠IgG 抗体、HRP标记羊抗兔IgG抗体，购于Affinity（江苏）；Anti-Claudin1抗体，购于Abcam；Amylase抗体、Pancreatic Lipase抗体（A-3）、Occludin抗体购于圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司。
2.2 实验方法
2.2.1 动物实验
a、动物实验流程
84只雄性C57BL/6J小鼠（5周龄）来自浙江维通利华，在江南大学实验动物中心（许可证编号:SYXK2016-0045）的屏障环境中（温度设置25±2 ℃；湿度设置50+5%；昼夜交替循环12 h）饲养。根据江南大学实验动物中心的管理规定，实验过程严格遵循相关操作流程。达到江南大学实验动物伦理委员会评议标准，批准编号（IACUC Issue No.）：JN.No20221030c0960115[449]。适应1周后，小鼠随机分两大组，正常饮水组（SPF）和抗生素饮水组（ABX，A）。ABX组在饮用水中给予万古霉素（0.5 g /L）、氨苄西林（1 g/ L）、新霉素（1 g /L）和甲硝唑（1 g /L）联合应用[50]，抗生素完全溶解于水中并两天更换一次。抗生素联合应用两周清除肠道微生物，之后将ABX组与正常饮水组分为12组，分别给与12周的正常饲料（ND）、高淀粉饲料（HSD）、高脂肪饲料（HFD）、正常饲料同时奥利司他灌胃（ND+O）、高淀粉饲料同时奥利司他灌胃（HSD+O）和高脂肪饲料同时奥利司他灌胃（HFD+O）。因此，在本实验中，干预组给与奥利司他（Orlistat，O）50 mg/kg一天两次灌胃，对照组小鼠灌胃同等量生理盐水。共12组，每组随机分配7只小鼠，分别为正常饮水组ND、ND+O、HSD、HSD+O、HFD、HFD+O；抗生素饮水组AND、AND+O、AHSD、AHSD+O、AHFD和AHFD+O。依据上述方案进行组别干预后，每日按固定时间进行灌胃给药，所有小鼠的操作人员均为同一人。在干预期间，分别对各组小鼠进行每周体重和血糖的监测，同时收集粪便标本。干预期间，动物实验流程如图2-1所示。
第三章 结果与讨论 ......................... 14
3.1 肠道菌群对奥利司他改善糖脂代谢作用的影响 ........................ 14
3.1.1 清除肠道菌群提高奥利司他改善高脂饮食导致体重血糖升高的作用 ........................... 14
3.1.2 清除肠道菌群增强奥利司他改善脂肪组织及肝脏组织的组织学表现 ...................... 15
主要结论与展望 ................................... 39
第三章 结果与讨论
3.1 肠道菌群对奥利司他改善糖脂代谢作用的影响
3.1.1 清除肠道菌群提高奥利司他改善高脂饮食导致体重血糖升高的作用
小鼠灌胃奥利司他12周后，正常饮食饲喂小鼠的体重组间比较，AND组比ND组体重减轻（P<0.05），其余组间体重差异无统计学意义。高淀粉饮食饲喂小鼠组间比较，以及与正常饮食饲喂小鼠组间比较，SPF及ABX小鼠是否用奥利司他干预，组间体重均无统计学差异。在高脂饮食与正常饮食饲喂小鼠组间比较，SPF小鼠中HFD组比ND组小鼠体重明显升高（P<0.001），HFD+O组体重比ND+O组显著升高（P<0.05）；ABX小鼠中AHFD组比AND组体重升高（P<0.001），然而AHFD+O组相较于AND+O组体重差异无统计学意义。高脂饮食饲喂小鼠组间比较，HFD+O组相较HFD组、AHFD组相较HFD组体重均无统计学差异；ABX小鼠奥利司他干预后，AHFD+O组相较HFD+O组体重有降低的趋势（P=0.052），AHFD+O组比AHFD组体重明显降低（P<0.01），同时AHFD+O组体重降低至ND组水平（图3-1A）。
随后，对各组小鼠的皮下脂肪及附睾（内脏）脂肪重量进行比较。结果显示，皮下脂肪及附睾脂肪重量组间变化与体重相似，正常饮食及高淀粉饮食饲喂小鼠组间的皮下脂肪及附睾脂肪重量均无统计学差异。正常饮食与高脂饮食饲喂的小鼠组间比较，HFD组比ND组、HFD+O组比ND+O组、AHFD组比AND组皮下脂肪及附睾脂肪重量均升高（P<0.05）；然而，AHFD+O组相较AND+O组重量无显著差异。高脂饮食饲喂小鼠组间比较，HFD组相较其他组皮下脂肪及附睾脂肪重量均明显升高；在皮下脂肪重量方面，SPF小鼠HFD+O组相较HFD组明显降低（P<0.01），ABX小鼠AHFD+O组显著低于AHFD组（P<0.01）；在附睾脂肪重量方面，AHFD+O组相较HFD+O组明显降低（P<0.001），同时也显著低于AHFD组（P<0.001）；然而，AHFD+O组的皮下脂肪及附睾脂肪重量较其他组显著降低，可接近ND组水平（图3-1B、C）。进一步对血脂四项指标进行检测，结果显示，相较于正常饮食和高淀粉饮食饲喂小鼠，高脂饮食饲喂小鼠的CHOL、LDL-C以及HDL-C水平均有所上升。尽管在高脂饮食小鼠应用奥利司他及抗生素干预后，这些指标呈现降低趋势，但并未观察到显著性差异。同时，TG水平在各组之间未表现出明显差异（图3-1D）。
主要结论与展望
主要结论：
1、正常饮食、高淀粉饮食与高脂饮食的小鼠比较，奥利司他只对高脂饮食饲喂的小鼠有减重的作用；高脂饲料喂养的小鼠，用奥利司他干预后的肠道菌群有阻止体重显著下降的作用。
2、清除肠道菌群同时进行奥利司他干预，能显著提高胰腺脂肪酶的分泌，说明奥利司他可以促进胰腺脂肪酶代偿性分泌，然而肠道菌群有阻止此过程发生的作用。
3、高脂饮食的小鼠肠道菌群构成发生了改变，表现在糖脂代谢相关的肠道菌群增加。在高脂饮食小鼠用奥利司他干预后，肠道中与聚糖分解相关的细菌富集，通过KEGG注释发现这些细菌同时参与鞘脂代谢途径。
4、高脂饮食小鼠在奥利司他干预后的粪便中鞘脂类脂质神经酰胺增多，清除肠道菌群后神经酰胺减少，证明奥利司他干预导致的神经酰胺增多是由肠道菌群介导的。由于肠道菌群来源的神经酰胺有促进机体脂质积累的作用，说明高脂饮食小鼠奥利司他干预后的肠道菌群可能通过产生神经酰胺减弱奥利司他的减重效果。
5、奥利司他干预可以改善高脂饮食小鼠的肠屏障功能，而在抗生素饮水组高脂饮食小鼠肠道屏障功能损伤严重，且奥利司他干预无法修复清除肠道菌群导致的肠屏障损伤。
参考文献（略）