本文是一篇医学论文，本研究表明：体外培养的绵羊FGCs的细胞质中表达KISS-1基因；KP-10能通过促进绵羊FGCs增殖、抑制细胞凋亡，或上调FGCs中类固醇激素合成关键酶的表达，显著促进绵羊FGCs中类固醇激素的合成分泌；在绵羊FGCs中KP-10可以通过PI3K/AKT信号通路调控FGCs细胞增殖、抑制细胞凋亡。
第一章文献综述
1.Kisspeptins/GPR54的简介
1.1 Kisspeptins的结构及特征
1996年Lee等[1]在人黑色素瘤细胞中发现了KISS-1基因，该基因具有肿瘤抑制和细胞转移的能力，在人类的大脑、肝脏、胎盘、卵巢等部位均有表达。KISS-1基因位置定位在人类染色体上lq32~41区域，该基因结构由四个外显子和三个内含子组成，其中前两个外显子没有翻译。而且后两个外显子只有部分被翻译，其中第1个外显子含109个未编码碱基，第2个外显子含91个未编码碱基，第3个外显子包括38个未被编码碱基以及103个能被编码的碱基，其中第4个外显子碱基数量最多，结构最大，其包含了332个能被编码的碱基以及121个未被编码碱基（一个终止子以及多腺苷酸化信号）[2]。Kisspeptins多肽家族是KISS-1基因编码的，是一个含有145个氨基酸的蛋白质，包含一个19个氨基酸的信号肽和一个54个氨基酸的中心区域，以及两个潜在的双碱性切割位点(在氨基酸57和67上)和一个假定的末端裂解和酰胺化位点(在氨基酸121~124上)，分泌肽位于氨基酸68~121之间，蛋白酶经过此段区域后首先产生具有生物活性的Kisspeptin-54（也称Metastin），随后Kisspeptin-54经过蛋白酶的再次水解会形成不同的亚型，将Kisspeptin-54（KP-54）再次水解后形成的氨基酸短肽根据氨基酸链长度的不同将其划分为Kisspeptin-14（KP-14）、Kisspeptin-13（KP-13）、Kisspeptin-10（KP-10），这些氨基酸短肽统称为Kisspeptins多肽家族（如图1）[3]。KP-54、KP-14、KP-13、KP-10氨基酸短肽在结构上都属于酰胺化短肽，其在C端均具有精氨酸-苯丙氨酸酞胺基(RF-NH2)结构[4]，都属于RF-酰胺化修饰结构，具有相似的生物学活性，均能与Kisspeptin受体(GPR54)进行特异性结合。根据已有研究表明，已从许多动物中克隆出KISS-1基因的cD NA序列，其中包括人类、牛、小鼠、猴等动物。通过对已知动物的氨基酸序列相似性的比较分析表明，灵长类哺乳动物之间的氨基酸序列相似性超过85%，而人类与啮齿动物之间的氨基酸序列相似性在45%~50%之间[5]。
1.2.Kisspeptin受体(GPR54)的结构及功能
Kisspeptins多肽家族主要通过与其GPR54受体（又称KISS-1R）结合而发挥相应生理功能[6]。该受体是一种G蛋白偶联受体，具有7个跨膜区域，而且由ɑ-、β-和γ-三类亚基组成[7]。其与甘丙肽受体以及阿片类受体家族的氨基酸序列具有高度相似性，在甘丙肽受体家族的氨基酸序列中存在几个保守残基，而甘丙肽会与其相结合而发挥作用，是甘丙肽受体家族氨基酸序列的重要序列区域，但该区域在GPR54受体中并不保守，所以甘丙肽与GPR54之间不具备亲和力，GPR54并不会被甘丙肽以及阿片类物质激活[8]。人类的GPR54基因包含5个外显子和4个内含子，其定位于人类第19号染色体上，又称为AXOR12或hoT7T175，该基因的开放式阅读框（ORF）长度为1197个碱基对，其编码得到398个氨基酸[6,9]；而大鼠的ORF长度为1191个碱基对，其编码得到396个氨基酸，二者氨基酸序列同源性在物种间高度保守。小鼠和大鼠之间的氨基酸序列相似性有95%，大鼠和人类之间的氨基酸序列相似性有82%[10]。绵羊GPR54基因的ORF长度为1137个碱基对，共编码378个氨基酸；绵羊和人之间的的氨基酸序列相似性为81%。Roa等[11]发现，人类与哺乳动物之间氨基酸序列相似性程度较高，可以达到80%以上，但人类与水生动物或两栖动物之间氨基酸序列相似性程度偏低，仅只有45%左右，可见GPR54基因在物种之间具有高度保守性而且进化程度极其的神奇。Kisspeptin与GPR54结合后，激活效应蛋白磷脂酶C(PhospholipaseC，PLC)，被活化的PLC随后将磷脂酰肌醇二磷酸(Phosphatidylinosital Biphosphate，PIP2)水解为三磷酸肌醇(Inositol-triphosphate，IP3)以及二酰甘油(Diacylglycerol，DAG)，IP3在细胞质内刺激内质网中的Ca2+通道使细胞内Ca2+浓度增加，改变细胞内渗透压；
2.Kisspeptin的定位及生理作用
2.1.Kisspeptin在下丘脑中的定位及生理作用
在啮齿动物中，Kisspeptin神经元主要位于下丘脑中的两个独立区域，即前腹周核（AVPV）和弓形核（ARC），而在家畜动物中，如猪、马、牛和羊的Kisspeptin神经元主要存在于下丘脑ARC中，以及在牛和羊的视前区（POA）以及猪的脑室周核（PeN）等区域也存在Kisspeptin神经元[13,14]。在雌性大鼠脑部通过荧光显微镜和电子显微镜观察发现Kisspeptin神经元与GnRH神经元直接相邻，但二者不是通过突触的方式进行连接[15]；在人体内Kisspeptin神经元主要定位于GnRH神经元的ARC和AVPV区域的周围，Kisspeptin神经元的轴突部分在分泌GnRH的漏斗柄区域周围形成了一种密集的毛细血管丛[16]。下丘脑AVPV的Kisspeptin神经元受到雌激素刺激并活化孕酮受体(PRs)协同作用，提高促性腺激素释放激素（GnRH）分泌，引发促卵泡生成激素（FSH）和促黄体生成素（LH）的分泌增加[14]。
2.2.Kisspeptin在卵巢中的定位及生理作用
2004年，Terao等[17]人首次在大鼠的卵巢中检测到KISS-1 mRNA表达，随后的研究发现在哺乳类动物以及人类的卵巢组织中均存在KISS-1和KISS-1RmRNA的表达[18]。在对人类卵巢组织的研究中发现，在卵母细胞、壁层颗粒细胞、颗粒细胞、黄体细胞、间质细胞以及上皮细胞中均有KISS-1和KISS-1RmRNA表达，其中颗粒细胞KISS-1 mRNA的表达量明显高于黄体细胞、卵母细胞和间质细胞等[19,20]。这说明颗粒细胞可能是合成卵巢Kisspeptins多肽家族的重要部位。
之后的研究发现KISS-1基因表达水平与青春期的发展有关。在没有排卵的大鼠卵巢组织中，KISS-1 mRNA的表达非常低，在促性腺激素的作用下明显增加。在成年大鼠中，KISS-1 mRNA在除发情外的所有阶段都在卵巢颗粒细胞和黄体中持续表达，在发情前期表达增加，然后急剧下降，在发情前期仅轻微增加。而且抑制排卵前大鼠的促性腺激素分泌会降低KISS-1 mRNA在卵巢组织中的表达[21]。相反GPR54 mRNA水平在大鼠整个月经周期中保持低水平，没有明显变化。f.Gaytan等[22]人发现GPR54 mRNA在人类卵巢月经周期中在成熟卵泡的卵泡膜层中表达，并在排卵后通过免疫染色定位于在未完全黄素化的颗粒细胞中。研究表明，在西伯利亚仓鼠发情前期和间期的卵泡和黄体细胞中KISS-1 mRNA表现出高表达；GPR54 mRNA在次级卵泡、成熟卵泡和黄体细胞中表达，并且在发情前相对高度表达，而在发情前和发情后期表达减少。Z.Merhi等[23]发现，KISS-1基因的表达与年龄有关，老龄小鼠卵巢中KISS-1和GPR54 mRNA水平明显高于幼龄小鼠；在人的卵泡颗粒细胞中，GPR54 mRNA表达水平与年龄呈正相关性。M．E．Cielesh等[24]研究发现Kisspeptin在母犬发情周期的所有阶段的卵母细胞中被发现，表明Kisspeptin除了在神经系统中起调节作用，在卵巢中也发挥局部调控功能，调控卵泡的发育。
第三章 Kisspeptin-10 对绵羊 FGCs 细胞激素分泌的影响及作用机制 ................................. 19
前言 ......................................... 19
1 材料与方法 ..................................... 20
1.1 试验材料 ....................................... 20
1.2 试验方法 ................................. 20
第四章 转录组分析 KP-10 对绵羊 FGCs 细胞增殖与周期相关效应因子 ...................... 28
前言 ................................... 28
1 材料与方法 ............................. 29
1.1 试验材料 ................................. 29
1.2 试验方法 .............................. 29
第五章 KP-10 对绵羊 FGCs 的增殖和凋亡的影响及作用机制 ...... 38
前言 ............................... 38
材料与方法 ............................ 38
1.1 试验材料 ............................ 38
1.2 试验方法 ....................................... 40
3讨论
细胞凋亡，也称为细胞程序性死亡，是由相关基因控制的细胞有序死亡的过程，能够保持内部环境的稳定。凋亡是一个十分复杂的过程，凋亡基因在其中扮演着重要的角色。Bcl-2与Bax蛋白是凋亡调控中相互拮抗的蛋白，Bcl-2蛋白表达量高时能够促进Bax/Bcl-2异源二聚体的形成，并阻止Bax/Bcl-2同源二聚体的形成，从而防止促凋亡因子如细胞色素c的释放。而当Bax蛋白表达量高时，会形成Bax/Bcl-2同源二聚体，并抑制Bax/Bcl-2异源二聚体的形成，从而激活下游Caspase家族蛋白的表达，促进凋亡因子的释放，启动细胞凋亡[113,114]。Bcl-2是一种抗凋亡基因，而Bax和Caspase-3则是促进细胞凋亡基因，在诱导细胞凋亡过程中具有不可替代的作用。
卵泡发生闭锁的原因十分复杂，牵涉到多种调节因素，与FGCs的凋亡情况密切相关。卵泡闭锁是指卵泡及卵母细胞在发育过程中停止生长并逐渐退化的过程，在体内卵泡大量闭锁会导致繁殖能力下降。在哺乳动物中，卵泡闭锁可以发生在卵泡发育的任何阶段。一般卵泡闭锁有两种情况，第一种是卵母细胞在卵泡发育之前就开始凋亡导致卵泡发生闭锁，另外一种则是卵泡在开始发育后，FGCs受到多种因素的调控发生凋亡导致卵泡发生闭锁。随着卵巢研究的逐渐深入，研究者发现卵泡闭锁与FGCs凋亡之间存在非常紧密的关系[132]。FGCs是卵泡中整体数量和生物功能占比最多的细胞，是重要的类固醇激素分泌合成的细胞。它可以和卵泡膜细胞互相产生作用，为促进卵泡的生长发育成熟提供雌激素，并且雌激素能够下调促凋亡基因的表达来提高卵泡内FGCs的细胞存活率，从而防止卵泡发生闭锁。此外，FGCs能够分泌卵泡生长发育所必需的生长因子、性腺类固醇激素、细胞因子等，并且能够避免氧化应激等外界因素对卵母细胞造成的损伤[133]。一旦FGCs开始凋亡，会导致卵泡内的生物功能丧失，细胞间的调控失衡，膜细胞和卵母细胞之间也会随之发生凋亡现象。当卵泡中FGCs的凋亡数量达到FGCs细胞总数的十分之一时，显示着卵泡已经进入闭锁的状态。因此，FGCs凋亡是导致卵泡闭锁的主要原因之一。
全文总结
1.结论
(1)体外培养的FGCs的细胞质中表达KISS-1基因。
(2)Kisspeptin-10能促进FGCs中类固醇激素的合成与分泌，并上调与类固醇激素的合成关键酶相关的基因。
(3)RNA-seq测序技术筛选总共有202个差异显著基因，其中上调表达基因119个，下调表达基因83个。其中202个差异基因富集在51个信号通路中，主要的信号通路有PI3K/AKT信号通路、神经营养蛋白信号通路、细胞凋亡、鞘脂信号通路、细胞外基质受体信号通路、p53信号通路、RIG-I样受体信号通路等。
(4)Kisspeptin-10能可以通过PI3K/AKT信号通路调控FGCs细胞增殖、抑制细胞凋亡。
参考文献（略）