本文是一篇医学论文，本研究首次发现了VDAC1在先天性免疫调控中的作用，为该蛋白的相关研究填补了空白，也为研究HEV感染的致病机制提供了重要线索。
第一章 文献综述
1戊型肝炎病毒研究进展
1.1 概述
戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）引起的人和动物肝脏慢性炎症的一种人畜共患病，主要经粪口途径传播。自从猪HEV被发现，动物传染病的传播风险已经成为一个备受关注的公共卫生问题，大多数急性戊型肝炎感染都与食用被污染的猪肉或猪的肝脏有关。HEV是全球范围内急性病毒性肝炎的主要原因之一，在免疫力低下的患者中发展为慢性感染的风险很高[1]。因此，亚洲、非洲、南美洲等一些经济条件、医疗卫生条件落后的发展中国家都是HEV的高发地区[2]。全球每年有2000万人感染HEV，其中有330万人会出现戊肝症状，高达0.15～1.1亿人最近或正在感染HEV。每年大约导致4.4万人死亡（占病毒性肝炎死亡率的3.3%），而孕妇患者的病死率则高达20%～25%，妊娠期间的孕妇感染后可出现病毒血症而造成流产，目前HEV依旧是世界卫生组织的公共问题[3]。
1.2 HEV基因组
HEV是一种基因组大小为7.2 kb的单股正链RNA病毒，HEV病毒有包膜状和非包膜两种模式[4]，从HEV患者的粪便样本中提取的HEV病毒粒子为27 nm～34 nm大小的非包膜形式[5]，而从HEV患者的血清中收集到的HEV病毒是包膜形式的[6]。HEV基因组由5’UTR（非编码区），以及三个开放阅读框（Open reading frame，ORF）组成[7]，5’端有帽子结构，3’端有多聚腺酸结构。其中ORF1蛋白编码病毒RNA复制所需的复制酶[8]，ORF1在不同基因型中存在差异，研究表明ORF1与病毒的感染和致病性相关[9]。ORF2蛋白编码病毒的衣壳蛋白，长度为660个氨基酸，主要的功能为保护病毒基因组的完整性，ORF2同时也参与重要的生理活动，其中包括病毒的装配、侵染以及与宿主互作[10]。
2 VDAC1的研究进展
线粒体作为细胞的能量发电站，不仅是生物合成和生物能源生产场所，还参与调节细胞稳态、新陈代谢、先天免疫反应、细胞凋亡和表观遗传等细胞活动，几乎在细胞生物学的所有方面都发挥着至关重要的作用。以上功能通常以线粒体内外的代谢通路为中心，而位于线粒体外膜的“守门员”-电压依赖性阴离子通道1（Voltage-dependent anion channel 1，VDAC1）负责调节线粒体与细胞其他组份之间的代谢物和能量交互，并在线粒体介导的细胞凋亡中发挥重要作用[41-42]。
VDAC1表达紊乱造成的线粒体功能障碍与多种疾病有关，包括癌症[43]、神经退行性疾病[44-46]、2型糖尿病(T2D)[47]、自身免疫疾病[48]和非酒精性脂肪肝[49]等。此外，VDAC1也参与病毒的感染过程，影响病毒的复制能力[50-51]或调控感染细胞的凋亡[52]。
2.1 VDAC1的结构
哺乳动物的电压依赖性阴离子通道家族（VDAC）有三种亚型（VDAC1、VDAC2和VDAC3），它们具有相似的结构和功能[53]。其中VDAC1是最丰富的亚型；VDAC2的敲除会致死，被认为是一种抗凋亡蛋白；而对有通道蛋白活性的VDAC3的研究最少。VDAC1的氨基酸序列中含有2个半胱氨酸，而VDAC2和VDAC3分别含有9个和6个半胱氨酸，这些半胱氨酸被认为在氧化应激传感器功能中起作用[54]。VDAC1包含19个平行排列的跨膜β折叠（β1~β19）组成的β桶状结构（图1），每个β折叠（约含有10个氨基酸）由柔性环状结构相连接，在线粒体外模上形成的通道孔径约为3.1 nm~3.5 nm。
第二章 HEV ORF2互作蛋白的筛选与鉴定
1实验材料与主要设备
1.1细胞株与质粒
人肝癌细胞（Huh-7和HepG2）、人胚胎肾细胞（HEK-293T）由本实验室保存，HEV Kernow C1/P6（KerORF2）质粒、pCMV-3×Flag、pCMV-HA和pCMV-myc均由西北民族大学生物医学研究中心提供。
1.2主要试剂及仪器
2.实验方法
2.1 转录组学分析慢性HEV的关键Maker蛋白
使用关键词“慢性戊型肝炎感染”在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中搜索相关的人类微阵列数据，并确定只有一个匹配的数据集(Accession No.GSE36539，GPL6480)来自前瞻性病例对照研究。该转录组数据集包括8个全血样本和8个单核细胞样本，样本分别来自感染或者未感染慢性戊型肝炎（Chronic hepatitis E，CHE）的肾移植患者。其中对照组患者无病毒感染，并根据肾移植后时间、性别、年龄和免疫抑制治疗等因素与CHE患者进行匹配。使用R语言中的limma包(4.1.1版本，http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html)中的normalize BetweenArrays函数对GSE36539基因表达图谱进行归一化，以便进一步分析, 使用语言中的limma包在GSE36539数据集中进行CHE患者与对照组患者的差异表达分析。根据调整后的P值<0.05和t检验鉴定DEGs，此外，Benjamini-Hochberg (BH)方法与阈值|Log(FC)|>1用于校正多次比较。
为了筛选CHE关键的生物标志物采用了四种算法。其中基于DEGs在R语言中进行了三种算法，包括使用random Forest包的随机森林(RF)分析法，使用glmnet包的最小绝对收缩和选择(LASSO)逻辑回归法，以及使用e1071包的支持向量机(SVM-RFE)法，分别对RFE和SVM分类集进行了五次交叉验证。使用R语言中的WGCNA包对GSE36539数据集进行WGCNA分析利以及GO-KEGG富集分析，并用维恩图(Venn diagram)对上述4种分析的重叠基因进行了鉴定并进行了进一步分析。
第三章 VDAC1 调控I型干扰素信号通路的分子机制初探 ............. 36
1 实验材料与主要实验设备........................ 36
1.1 细胞株与质粒 ................................... 36
1.2 主要试剂及仪器 ............................... 36
第四章 全文结论 .......................... 56
第三章 VDAC1调控I型干扰素信号通路的分子机制初探
3 实验结果
3.1 过表达VDAC1对IFN-I信号通路IFN-β的mRNA水平的影响
在293细胞中过表达VDAC1 24 h后转染Poly（I﹕C）激活剂和不加Poly（I﹕C）激活剂情况下，36h后收集细胞进行RT-qPCR实验。结果表明，过表达VDAC1能够抑制激活剂诱导的IFN-β的表达（图1）。
第四章 全文结论
1、基于转录组分析数据集获得23个差异表达基因，它们主要参与I型干扰素应答、I型干扰素信号途径和病毒应答(丙型肝炎等)、病毒防御应答等生物学过程；然后，结合四种机器-学习算法（RF、LASSO、SVM和WGCNA），筛选获得慢性HEV感染相关的2个关键生物标志基因（VDAC1和BATF2）。
2、以HEV ORF2为诱饵蛋白，筛选人类肝癌细胞（Huh-7）中与之互作的宿主细胞蛋白，获得37个候选蛋白，结合前期结果，选取VDAC1为靶蛋白。经验证发现ORF2与VDAC1存在相互作用和共定位现象，并且随着ORF2表达量升高VDAC1表达水平下调。
3、VDAC1的表达负调控IFN-β的产生；VDAC1过表达会下调MDA5、MAVS、TBK1（及其磷酸化）以及磷酸化的IRF3的表达水平；经筛选发现VDAC1与MAVS、TBK1和IRF3均存在相互作用，揭示了在该信号通路途径中，VDAC1的接头分子为IRF3。
4、VDAC1与IRF3存在共定位现象，并且显著抑制IRF3蛋白的核移位，暗示VDAC1通过与IRF3的结合抑制IRF3入核过程。 综上，本研究首次发现了VDAC1在先天性免疫调控中的作用，为该蛋白的相关研究填补了空白，也为研究HEV感染的致病机制提供了重要线索。
参考文献（略）