布鲁氏菌感染宿主细胞过程中TBK1对炎症信号通路的调控机制探讨

发布时间:2023-01-28 22:19:16 论文编辑:vicky

本文是一篇医学论文,本文揭示了鲁氏菌感染期间,布鲁氏菌分泌蛋白BMCO通过靶向TBK1,抑制NF-κB信号通路活性,降低宿主促炎性细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的表达水平,提高布鲁氏菌在胞内的存活数量,为进一步全名认识布鲁氏菌胞内免疫逃逸机制提出了新的观点。

第一章绪论

1.2国内外研究进展

1.2.1布鲁氏菌病原学特性

1.2.1.1形态特性

布鲁氏菌,革兰氏阴性胞内寄生菌,无动力、无芽孢,大小为0.6~1.5μm×0.5~0.7μm,初次分离时多成球状、球杆状或椭圆形,传代培养后逐渐呈现小杆状,菌体无鞭毛且不形成荚膜[5]。涂片检查多见单个、串状、短链状排列,偶见成对排列。可用碱性染料染色,姬姆萨染色为红色,对苯胺染料吸附缓慢,经科兹洛夫斯基或其他相关差异染色方法染色后,可表现出特殊的染色反应[6]。

1.2.1.2培养特性

布鲁氏菌是绝对嗜氧菌,但多种菌株仍需要10%的CO2环境,研究表明,布鲁氏菌的最适培养条件为:PH≈6.6-7.4之间,温度:36-37℃。该菌的培养过程中对培养基要求很高,生长繁殖时需要多种氨基酸(amino acid)、维生素(vitamin)、菸草酸(Tobaccoacid)、生物素(biotin)、泛酸钙(calcium pantothenate)等营养物质[7]。因此,在进行布鲁氏菌扩繁时,通常会向培养基中添加牛或羊的新鲜胎盘或10%兔血清。布鲁氏菌的生长速度非常缓慢,首次分离培养需要10天甚至20-30天,实验室传代的甘油冻存菌株,通常情况下只需要48-72h即可达到对数生长期[8]。

1.2.1.3生化特性

和其他许多革兰氏阴性菌不同,布鲁氏菌对于糖原的分解能力相对较差,通产条件下,只能分解葡萄糖而产生少量的酸性物质,不能产生气体[9]。但是最近又有研究表明,布鲁氏菌的少数其他种属也能分解蔗糖、鼠李糖、麦芽糖。布鲁氏菌不能产生吲哚,不凝固牛乳,不能利用柠檬酸盐,不能从O-硝基酸-B-D-半乳糖苷中释放O-硝基酸,不液化明胶,除羊种布鲁氏菌(Brucella ovis)外,其他种属菌均不能还原硝酸盐[10]。根据其LPS(脂多糖)中O抗原的完整性,可以将布鲁氏菌划分为两类,即粗糙型布鲁氏菌(R型)和光滑型布鲁氏菌(S型)。当布鲁氏菌胞壁的黏肽(mucopeptide)受损时,也会变为胞壁不完整的L型。研究表明,O抗原对布鲁氏菌的早期胞内存活具有重要作用,O抗原的缺失,更容易引起宿主细胞P65因子的入核,诱导巨噬细胞凋亡,降低R型布鲁氏菌的毒力水平[11-12]。根据这一特性,R型布鲁氏菌被广泛的应用于减毒疫苗的生产研发中,其中,布鲁氏菌RB51疫苗株成为最为典型的代表。

第三章TBK1参与布鲁氏菌体外感染宿主细胞诱发的促炎反应

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.1.1细胞及菌株

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)、布鲁氏菌2308均由新疆石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室保存。

3.1.1.2主要试剂

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第五章布鲁氏菌分泌蛋白BMCO通过与TBK1结合抑制宿主先天固有免疫应答

5.1材料与方法

5.1.1试验材料

5.1.1.1细胞、菌株与质粒

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)由新疆石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室保存。本试验所需菌株和质粒如表5-1所示:

医学论文参考

5.2结果

5.2.1融合PCR缺失株载体的构建

利用BMCO上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因特异性引物,对BMCO上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因进行PCR扩增,扩增结果如图5-1A、5-1B、5-1C所示。通过融合PCR对三段序列进行融合,融合产物以BMCO上游同源臂的上游引物和BMCO下游同源臂的下游引物特异性扩增融合片段,扩增结果如图5-1D所示。对扩增结果进行送至上海生工生物技术工程有限公司进行双向测序,与预期结果相符,表明片段融合扩增成功。

测序无误的融合片段连接于PMD19-T,构建重组载体。重组载体电转至流产型布鲁氏菌S2308,涂布于布鲁氏菌卡那霉素抗性肉汤培养基。挑去阳性菌落,进行传代培养,对第10代阳性菌落进行菌液PCR检测,结果表明,以BMCO为特异性引物,缺失株中不能检测到BMCO基因的特异性条带,BMCO-N-F和BMCO-C-R和Kan基因引物分别检测出现特异性条带大小分别为2115和1054 bp(图5-2),和预期结果相符,说明成功构建可以稳定遗传的BMCO基因缺失株,即S2308ΔBMCO。

第七章论文创新点

1.构建布鲁氏菌分泌蛋白酵母双杂交文库,建立布鲁氏菌分泌蛋白酵母双杂交筛选系统,首次筛选、鉴定、验证了一个与固有免疫中心节点蛋白TBK1存在相互作用的布鲁氏菌分泌蛋白。

2.揭示了鲁氏菌感染期间,布鲁氏菌分泌蛋白BMCO通过靶向TBK1,抑制NF-κB信号通路活性,降低宿主促炎性细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的表达水平,提高布鲁氏菌在胞内的存活数量,为进一步全名认识布鲁氏菌胞内免疫逃逸机制提出了新的观点。

参考文献(略)

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