本文是一篇医学论文，本研究在前期研究和发现的基础上，以病理学、毒物分析、分子生物学等相应技术为手段，利用体内、外实验，探索博落回急性中毒介导窦房结细胞毒性损伤作用过程中分子病理学表现，本文通过探讨这些现象，讨论可能发生的原因。
研究材料（资料、内容）与方法
1.材料
1.1 实验动物
实验选用清洁级家兔，购自湖南省长沙市天勤生物技术有限公司，体质量1800±100g。自由采食，进食、饮水及活动均正常，饲养于皖南医学院法医学院4楼动物房。新生 SD 大鼠，购于合肥市庐江县白湖工业园区，饲养于皖南医学院4楼动物房。
1.2 实验材料
1.2.1 主要仪器
涡旋仪（Vortex-2型） 皖南医学院法医病理实验室提供 双显恒温磁力搅拌器 皖南医学院法医病理实验室提供 制冰机（雪科 IMS-60） 皖南医学院法医病理实验室提供 脱色摇床（杰瑞安 TYYC-Ⅱ） 皖南医学院法医病理实验室提供 台式高速离心机（可成 MiniMax17） 皖南医学院法医病理实验室提供 台式低速离心机（可成 L2-5K） 皖南医学院法医病理实验室提供 分析天平（幸运电子 JA303H） 皖南医学院法医病理实验室提供 超纯水仪（赛默飞 D-63505） 皖南医学院法医病理实验室提供 超纯水仪（科宁特 KATR-I-20） 皖南医学院法医病理实验室提供 电泳仪（Bio-rad） 皖南医学院法医病理实验室提供 美的冰箱（-20℃、4℃） 皖南医学院法医病理实验室提供 转模槽（Bio-rad） 皖南医学院法医病理实验室提供
2. 实验方法
2.1 家兔经口急性毒性实验
急性毒性试验是一次或24小时内多次染毒的试验。由于博落回中毒致死案例，摄入方式一般为单次经口摄入过量导致中毒死亡，故本次实验给药采用单次经口摄入的方式。本实验采用此方式，用以测定博落回总碱的LD50并观察家兔博落回总碱中毒反应、濒死期表现、及组织病理学改变。
2.1.1 预实验确定家兔给药浓度梯度
博落回总碱粉末，恒温干燥箱内37℃ 24h 烘干，随机选取家兔，体重1.8±0.2kg，雌雄各半，灌胃前禁食24h并称重，称量不同质量的博落回总碱粉末,溶于最大给药容积的0.1%的羧甲基纤维素钠溶液反复实验进行家兔灌胃，通过反复试验，当同一剂量，随机连续3只实验动物同时发生死亡或同时发生中毒表现而未发生死亡时，得出在24h内引起家兔100%死亡的最小剂量（Dm）和不引起家兔死亡的最大剂量（Dn）。
2.1.2 霍恩法测定博落回总碱对家兔的LD50
以不引起死亡的最大剂量（Dn）为1倍剂量，在Dn与Dm之间，以2.15倍为组间距，确定给药浓度，采用霍恩法计算LD50[39]，随机选取家兔20只，体重1.8±0.2kg，雌雄各半，随机分为4组，每组5只。灌胃前禁食24h并称重，称量博落回提取物粉末,溶于最大给药容积的0.1%的羧甲基纤维素钠溶液进行灌胃[40]。
正式实验分为 3 个剂量（浓度）组：空白对照组（n=8）、LD50组（n=8）、2LD50组（n=8）。后续步骤样本均来自此步骤中的急性中毒死亡家兔。
结果
1.家兔经口急性毒性实验
1.1 预实验中毒剂量的确定
通过反复试验得出博落回总碱引起家兔 100%死亡的最小剂量（Dm）为2500mg/kg，不引起死亡的最大剂量（Dn）为121mg/kg。以121mg/kg作为一倍剂量，组距2.15倍，每组5只，采用霍恩法计算家兔博落回总碱的LD50。
1.2 霍恩法测定家兔博落回总碱LD50及 95%可信区间
经口灌胃一次给药，观察24h，计数家兔死亡情况，查表计算 LD50 及 95%可信区间，家兔死亡情况及时间见下表（对照组家兔灌胃24h后无死亡发生），LD50 510.62 mg/kg，95%可信区间为 (255.31-1021.24）mg/kg。
2. 高效液相色谱法定性检测博落回总碱及血清主要成分
博落回总碱中主要成分为血根碱及白屈菜红碱（图14）。
结果……………………32-39
讨论…………………………39-46
结论………………………………47
讨论
1.家兔经口急性毒性实验
1.1 博落回急性中毒造模组别设置
本文采用灌胃给药的方式，建立了家兔不同剂量博落回总碱急性中毒死亡模型。由于博落回总碱溶解度较低，结合本课题组既往实验方法，采用羧甲基纤维素钠溶液作为博落回总碱混悬剂，可保证灌胃药物均一稳定分散于溶剂。本次经预实验，得出博落回总碱引起家兔 100%死亡的最小剂量Dm为2500mg/kg，不引起死亡的最大剂量Dn为121mg/kg。根据上述实验结果，以2.15倍为组距，采用霍恩法计算LD50。正式试验家兔急性中毒死亡组建模按空白对照组、LD50组死亡组、2LD50组进行分组，以比较不同剂量死亡组与对照组的HCN4 蛋白表达的差异。根据本课题组前期实验[22]以及文献报道[43-45]， CMC-Na无毒，其溶液常作为毒理学实验灌胃药物的溶剂及空白对照组设置为羧甲基纤维素钠溶液灌胃。
1.2 家兔博落回急性中毒实验结果讨论
Masson三色染色法可见取材部位存在少量胶原纤维，确证组织病理学检查取材部位为家兔窦房结[46]。HE染色结果显示的部分肝细胞淡染气球样变，部分肝细胞核固缩，心肌波浪样变，脾、肾淤血均为中毒的特征性表现，均为非特异性病理改变。肝细胞和心肌细胞的组织病理学改变由其主要成分血根碱和白屈菜红碱的肝细胞毒性和心毒性有关。
免疫组织化学染色法及Western Blot检测博落回总碱中毒家兔窦房结组织HCN4蛋白表达情况，结果显示，HCN4主要表达于窦房结细胞胞质及胞膜，与对照组相比，中毒死亡组HCN4表达降低。HCN4是窦房结细胞If电流的通道蛋白[47]，If在人窦房结动作电位波形中处于活跃状态[48]，HCN4表达减少会导致窦房结副交感神经反应增强[49]，窦性心动过缓[33]，心率减慢，HCN4的错义突变也可能导致房室传导阻滞的发生[50]。既往案例中，曾有博落回中毒患者出现窦性心动过缓及房室传导阻滞的临床表现[51]，机制可能与本次实验中发现的HCN4减少有关。本文中发现的HCN4在窦房结表达减少或可为HCN4作为潜在检测家兔博落回中毒死亡后的法医病理学分子标记提供实验病理学参考。
结论
1． 博落回总碱主要成分为血根碱及白屈菜红碱；
2． 家兔急性博落回总碱中毒LD50 为 510.62mg/kg，其 95%可信区间为(255.31-1021.24)mg/kg，中毒主要靶器官无特征性组织病理学改变；
3． 中毒死组窦房结HCN4表达较对照组下调；
4． 血根碱对原代窦房结细胞的细胞毒性较其对原代心肌细胞的细胞毒性强；白屈菜红碱对原代窦房结细胞的细胞毒性较其对原代心肌细胞的细胞毒性强；
5． 在浓度相同时，血根碱较白屈菜红碱对对原代心肌细胞毒性强；在浓度相同时，血根碱较白屈菜红碱对原代窦房结细胞的毒性强。
6． HCN4有潜力成为心肌脂肪浸润致猝死的分子病理学标记。
参考文献（略）