茯苓皮总三萜脂质体的思考

发布时间:2022-04-22 23:20:33 论文编辑:vicky

本文是一篇高校毕业论文,本实验制备的脂质体载药量较低,由于载药量与包封率、粒径等指标密切相关,只能在保证包封率高,粒径小的前提下提高载药量,载药量可能与制备方法、药脂比、冻干保护剂种类和用量有关,因此后续可通过调整药脂比和冻干保护剂的用量等方法来提高其载药量;


第一部分 综述


1 茯苓皮总三萜的研究进展

1.1 茯苓皮总三萜的化学成分

茯苓皮中主要有多糖和三萜两类化学成分,而茯苓皮总三萜(TTP)作为三萜类中的主要化学成分,目前报道的有 84 种[20],主要包含羊毛甾-8-烯型、羊毛甾-7,9(11)-二烯型、3,4-开环-羊毛甾-8-烯型、3,4-开环-羊毛甾-7,9(11)-二烯型等[20]。

1.2 茯苓皮总三萜的药理作用

1.2.1 对泌尿系统作用

相关研究表明三萜类成分通过调控肾素-血管紧张素系统(RAS),防止细胞死亡,调节水和钠路径,平衡水分等途径调控泌尿系统[20]。

田婷等[21]报道在 150 至 600 mg·kg−1·d−1给药剂量范围内,茯苓皮乙醇提取物使大鼠尿量增加 21%到 42%,且增加保钾排钠作用,茯苓皮醇提取物的利尿作用可能是[21]由于茯苓皮中主含有四环三萜类化合物,它与醛固酮及其拮抗剂(如螺内酯等)结构相似,所以抑制了肾小管对电解质和水的重吸收。

三萜类成分具有良好的肾保护作用,可在一定程度防治肾病综合征等肾脏疾病。王明课题组[22]发现茯苓三萜酸,可通过调节 RAS 和减轻管间质纤维化(TIF)来治疗慢性肾病(CKD)。而 TIF 是 CKD 的共同病理特征,陈丹倩课题组[23]通过分离出茯苓酸 A,证明茯苓酸 A 通过选择性阻断 AMPK 下游的 Smad3 与 TGFβRI 和 SARA 的结合而抑制 Smad3 磷酸化,从而上调 AMPK 活性减轻肾间质纤维化。

肾病综合征与肾脏对水和钠的处理方式改变以及水通道蛋白(AQPs)和上皮钠通道(ENaCs)的水平变化有关。Lee 等[24]发现茯苓菌核水提物(200 mg/kg-1/天-1)通过抑制蛋白尿和腹水来改善肾病综合征 AQP2 和 ENaC 的表达,通过抑制水和钠通道影响体液调节,改善肾脏失调如水肿或肾病。


2 脂质体的研究进展

2.1 脂质体的概况

脂质体是由上世纪 60 年代英国科学家 Bangham 首次发现的[41],它主要包括磷脂和胆固醇两部分[42],可同时包载脂溶性和亲水性药物[43-44],具有良好的缓释、生物相容性、靶向性、可降解性和低毒性等优点[45-48],可通过配体修饰,形成如温敏脂质体[49]、pH 敏感脂质体[50]、前体脂质体[51]、长循环脂质体[52]等许多新型脂质体。

2.2 脂质体的制备方法

2.2.1 薄膜分散法

作为最常用的制备方法[53],它是将膜材溶解于溶剂中,通过旋蒸去除有机溶剂,形成薄膜,加入水化介质进行旋转,即得[54]。如潘文丽等[55]采用此法制备出了包封率高,具有缓释性的西洋参茎叶皂苷脂质体。

该法得到的脂质体粒径大小多不均一[56],因而常通过超声、过膜挤压等方法进一步减小粒径[57],目前主要用于包封亲脂性或两亲性物质[58]。

2.2.2 乙醇注入法

首先将膜材和药物溶于乙醇中,超声溶解后将此注入到恒温磁力搅拌的水相中,此时会得到脂质体混悬液[59]。常通过超滤、旋蒸、反渗透等[60]方法挥去乙醇,过膜挤压或超声等方法进一步减小脂质体粒径[57]。乙醇注入法绿色安全,可用于工业化生产[58]。如郝静梅等[61]采用此法制备的柠檬烯脂质体包封率为 67%左右,与模型预测误差相差甚微,重现性良好。


第二部分 处方前研究


2 含量测定方法的建立

2.1 色谱条件

色谱柱:Lichrospher C18(4.6 * 150 mm,5 μm)色谱柱;流动相:乙腈-0.5 %甲酸水(85:15);流速:1mL/min;柱温:30℃ ;进样量:10μL;检测波长: 244 nm

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备

精密称取松苓新酸和去氢依布里酸对照品于同一 10mL 量瓶中,用甲醇溶解并定容,制得松苓新酸、去氢依布里酸浓度分别为 200、204μg /mL 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密吸取 1mL 脂质体溶液至 2mL 容量瓶中,加入甲醇溶解,超声 15min,放冷,摇匀,过 0.45µm 微孔滤膜,即得。

2.2.3 空白对照溶液制备

按照 2.2.2 下制备方法,在不加药物的情况下,即得空白对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验

分别吸取上述 2.2.1、2.2.2、2.2.3 下溶液适量,按照 2.1 色谱条件下进样测定,结果空白对照溶液在 2 个对照品的相应位置上没有吸收峰,证明处方中的辅料对脂质体中的 2 个对照品测定没有干扰。


3 脂质体包封率的测定方法

吸取适量的脂质体溶液置于离心管中,于低温高速(14000r/min ,4℃)条件下离心,离心 30 min,弃去上清液后用甲醇溶解底部沉淀物,超声,将底部沉淀溶液转移至容量瓶中,按 2.1 色谱条件下进样测定药物质量,记为 W包。另取脂质体溶液适量加入容量瓶中,甲醇溶解定容,超声破乳,在上述色谱条件下进样测定脂质体中的总药量,记为 W总。包封率的计算公式为:

包封率(%)=W包/W总*100%

脂质体制备后,常采用透析法、离心法、柱层析法等进行包封率的测定,由于透析法所需透析时间较长,柱层析法往往所需样品量大、操作繁琐、稀释量大且易造成药物泄露[93],而离心法操作简单,用时较少,所需样品量小,因而本实验选用离心法测定包封率。

同时分别考察了 4000r/min、6000r/min 、8000r/min 、14000r/min 不同转速下脂质体和游离药物的分离情况,结果 14000r/min 可以快速将脂质体和游离药物良好分离,而其他转速均无法达到预期要求,因而最终确定了 14000r/min 作为离心转速。


第三部分 茯苓皮总三萜脂质体的制备工艺研究.....................14

1 仪器与试药............................................. 14

1.1 仪器............................... 14

1.2 试药与试剂...........................14

第四部分 透明质酸修饰的茯苓皮总三萜脂质体制备工艺优化........................ 24

1 仪器与试药............................ 24

1.1 仪器................................ 24

1.2 试药与试剂..................................24

第五部分 脂质体的质量评价及体外释放度研究...............32

1 仪器与试药....................... 32

1.1 仪器............................. 32

1.2 试药与试剂...........................32


第五部分 脂质体的质量评价及体外释放度研究


1 仪器与试药

1.1 仪器

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1.2 试药与试剂

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结语

脂质体作为一种新剂型,近年来被广泛应用于制剂领域,本实验基于提高茯苓皮总三萜的生物利用度,通过对茯苓皮总三萜脂质体的研究,主要完成了以下工作:

1.成功建立了茯苓皮总三萜脂质体含量的测定方法,并进行了方法学考察。通过对包封率测定方法的前期筛选,最终确定采用高速低温离心法。

2.脂质体的制备方法较多,本实验以包封率和粒径大小作为评价指标,最后选择了乙醇注入法。在单因素考察实验中,选择了几个影响较大的因素进行了考察,并通过正交试验优化,最终确定处方:磷脂-胆固醇质量比为 7:1,药脂比为 1:3,PBS 的 pH 值为 7.0,并进行了工艺验证。

3.在制备 HA 修饰的茯苓皮总三萜脂质体时,通过对 HA 的用量、搅拌转速、探头超声时间进行了单因素考察,最终确定处方为:采用电荷吸附法取 0.5mg/mL 的 HA水溶液并超声,将此 HA 水溶液缓慢滴入到不断搅拌的茯苓皮总三萜脂质体溶液中,磁力搅拌 30min(650 r/min,60℃),探头超声 2 min(10% 功率)使粒径均匀,即得 HA 修饰的茯苓皮总三萜脂质体溶液。

4.为了进一步提高脂质体溶液的稳定性,本实验采用了冷冻干燥法对 HA 修饰的茯苓皮总三萜脂质体进行了冻干工艺研究,通过对冻干保护剂的种类和用量进行筛选,最终确定脂质体冻干工艺为:称取卵磷脂、胆固醇、药物(磷脂-胆固醇质量比为 7:1,药脂比为 1:3),加入适量的无水乙醇超声溶解,吸取上述溶液,并注入到不断搅拌的 30mL PBS 中(pH=7.0),磁力搅拌 30 min,旋蒸除去乙醇(45℃),即得茯苓皮总三萜脂质体溶液。取 0.5mg/mL 的 HA 水溶液并超声,将此 HA 水溶液缓慢滴入到不断搅拌的已制备的茯苓皮总三萜脂质体溶液中,磁力搅拌30min(650 r/min,60℃),此时向脂体溶液中继续加入甘露醇(甘露醇-脂质体质量比 1.5:1),继续磁力搅拌 30 min,探头超声 2 min(10%功率)使粒径均匀,即得冻干脂质体溶液。按照 3.3 下冻干条件进行冷冻干燥,即得 HA 修饰的茯苓皮总三萜冻干脂质体。

参考文献(略)

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